溶血性貧血動物模型

溶血性貧血是由于紅細(xì)胞破壞增多、增速，超過造血代償能力時所發(fā)生的一組貧血。紅細(xì)胞的平均壽命為15～20d，紅細(xì)胞破壞速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過骨髓的代償潛力時，則出現(xiàn)貧血。溶血性貧血發(fā)病的基本問題是紅細(xì)胞壽命縮短，易于破壞。主要通過以下三方面的機(jī)制：紅細(xì)胞膜的異常變化；血紅蛋白的異常；機(jī)械性因素。

1 乙酰苯肼誘發(fā)的溶血性貧血大鼠模型

    (1)復(fù)制方法  體重為180～250g的雄性大鼠，大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。分別于造模的1, 4, 7日經(jīng)腹腔注射2％乙酰苯肼(Acetylphenylhydrazine, APH)生理鹽水溶液，初次注射劑量為1ml/100g體重，第2、3次劑量減半為0.5ml/100g體重。注射乙酰苯肼后，每天上午經(jīng)大鼠尾靜脈取血作血紅蛋白測定，并進(jìn)行血紅細(xì)胞計數(shù)和白細(xì)胞計數(shù)。通過不同方法分別作網(wǎng)織紅細(xì)胞、海氏小體(Heina body)、中性粒細(xì)胞、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、 ATP酶、琥珀酸脫氫酶(SKH)及葡萄糖-6-磷酸酶(G-6- P)染色。

    (2)模型特點(diǎn)  注射APH后第3日，模型大鼠開始出現(xiàn)疲乏無力，行動遲緩，嗜睡、喘息；面、眼、耳、尾蒼白，體溫偏低等臨床表現(xiàn)。肉眼觀察可見肝、脾均腫大，脾腫大尤為明顯，呈暗紅色。血液學(xué)觀察指標(biāo)：血紅蛋白和紅細(xì)胞呈進(jìn)行性下降，網(wǎng)織紅細(xì)胞、海氏小體和白細(xì)胞總數(shù)顯著增多(顯示出貧血性血象)。注射APH 1周后，模型動物血紅蛋白可下降為40～70g/L；紅細(xì)胞降為(200～400)×1000000000/L；白細(xì)胞降為(30～39)×1000000000/L；網(wǎng)織紅細(xì)胞則升為85％～95％，海氏小體升至30％～38％(正常為0)。血細(xì)胞組織化學(xué)染色觀察顯示中性粒細(xì)胞AKP、ACP、ATP酶、SDH和G-6-P酶均出現(xiàn)不同程度異常。

    (3)比較醫(yī)學(xué)  乙酰苯肼可引起骨髓造血干細(xì)胞生長發(fā)生變化，促使其從骨髓向脾臟轉(zhuǎn)移，而在代償期出現(xiàn)骨髓血細(xì)胞增多。紅細(xì)胞因中毒加速破壞，而骨髓造血功能又代償不足，從而導(dǎo)致貧血，白細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞則急劇增多。使用APH制作溶血性貧血是較經(jīng)典的方法。近年又出現(xiàn)運(yùn)用基因打靶、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)制作該模型，國內(nèi)應(yīng)用不廣泛，并且程序比較繁瑣、耗時多?？捎脕碇谱髂Ｐ偷膶?shí)驗(yàn)動物包括小鼠、大鼠、家兔等。溶血性貧血是指紅細(xì)胞破壞過速而骨髓造血功能代償不足所發(fā)生的貧血。本模型表現(xiàn)的臨床癥狀及血象、血細(xì)胞生化指標(biāo)與臨床上人類的溶血性貧血基本相似，用乙酰苯肼致溶血性貧血的動物模型是研究人類溶血性貧血的較理想的模型。

2 鹽酸苯肼誘發(fā)的溶血性貧血大鼠模型

    (1)復(fù)制方法  體重約為180g的SD雄性大鼠，將鹽酸苯肼用滅菌注射用水配制成5％溶液；按40mg/kg體重的劑量經(jīng)腹腔注射鹽酸苯肼，連續(xù)注射5d。注射鹽酸苯肼5d后，將大鼠常規(guī)麻醉，經(jīng)其股靜脈抽血，作血漿游離血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、變性珠蛋白小體、外周血紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞及血小板測定；并取大鼠股骨骨髓液涂片，觀察骨髓增生情況，計算粒紅比例；測定肝、脾重量，同時取動物骨髓、肝臟、脾臟組織，經(jīng)10％甲醛溶液固定后，作常規(guī)組織切片，HE染色，光鏡下觀察。

    (2)模型特點(diǎn)  注射5d后，模型大鼠表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、活動減少，尾部、口唇及四肢皮膚蒼白，尿液色深黃；紅細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白濃度明顯降低，網(wǎng)織紅細(xì)胞顯著增多；變性珠蛋白小體、游離Hb也增多，肝脾體積增大，重量增加，與正常對照大鼠比較有顯著差異。模型動物鏡下病理組織學(xué)觀察顯示，骨髓血管可見少量滲血，巨核細(xì)胞系、紅系增生活躍；肝細(xì)胞呈輕、中度顆粒樣變性，肝實(shí)質(zhì)淤血；脾臟紅髓擴(kuò)大彌散，紅細(xì)胞密集，脾竇充盈紅細(xì)胞，白髓受擠壓，并可見陳舊性出血。經(jīng)大鼠腹腔注射鹽酸苯肼5d后，動物可出現(xiàn)明顯的貧血體征，其血象和骨髓象呈溶血性貧血改變，并可造成部分組織器官的病理性損害。模型制備方法簡便，結(jié)果可靠，動物死亡率低，實(shí)用性好。

    (3)比較醫(yī)學(xué)  溶血性貧血是臨床上常見的造血系統(tǒng)疾病，目前尚無較好的治療方法。建立理想的溶血性貧血動物模型，對研究人類溶血性貧血的發(fā)病原因與機(jī)制、藥物療效觀察均具有重要意義。本模型采用鹽酸苯肼誘發(fā)大鼠溶血性貧血，其機(jī)制主要為當(dāng)苯肼經(jīng)機(jī)體腹腔注射吸收入血后，能迅速與氧合血紅蛋白反應(yīng)，生成高鐵血紅蛋白(MHb)、氮和苯。MHb是Hb分子變性的一個重要步驟，由于機(jī)體內(nèi)MHb的血紅素比氧合Hb的血紅素更易喪失，喪失了血紅素的珠蛋白則很容易沉淀。在正常情況下，紅細(xì)胞雖不斷與氧化劑如過氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和過氧化脂質(zhì)等接觸，但仍可保持其完整性。紅細(xì)胞中存在三種酶，即過氧化氫酶、還原型谷胱甘肽一過氧化物酶(GSHPX)和過氧化物歧酶(SOD)，這些酶可保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化損壞。但當(dāng)體內(nèi)O2-和H2O2的生成量超過了SOD和過氧化氫酶保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化損害的能力時，Hb、酶蛋白和膜蛋白的巰基可被氧化，Hb氧化則形成MHb和海因茨(Heinz)小體。海因茨小體沉積在紅細(xì)胞膜上，使其流動性降低，滲透性增加，導(dǎo)致氧化性溶血。同時苯肼可裂解一部分重要的膜功能區(qū)，在體外或注入大鼠體內(nèi)時，可抑制紅細(xì)胞膜上的 Ca依賴性ATP酶，導(dǎo)致紅細(xì)胞中的Ca濃度迅速增加。因此，推測紅細(xì)胞中Ca環(huán)境紊亂是氧化劑誘發(fā)溶血的一個重要因素；紅細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化也可加速溶血的產(chǎn)生，這是由于紅細(xì)胞中多不飽和脂肪酸和二烯鏈的喪失直接降低了膜的流動性及膜氨基亞氨丙烯交鏈的形成，因而破壞了紅細(xì)胞膜的正常功能。